Молекулярные механизмы взаимодействий пептидов и ДНК

1. Взаимодействия белков и пептидов с ДНК

Взаимодействие белка с ДНК

Взаимодействия с белками важны для всех функций ДНК: транскрипции и регуляции генов, репликации и репарации ДНК, упаковки ДНК в хромосомы [1, 7]. Белки, взаимодействующие с ДНК, могут быть классифицированы как те, что активно скользят вдоль нитей ДНК, и те, которые связываются с определенными участками ДНК. К первой группе относятся ДНК- и РНК-полимеразы. Из-за их последовательного взаимодействия с основаниями ДНК и постоянного контакта с ДНК их называют скользящими белками. Белки второй группы также движутся вдоль ДНК, однако не скользят, а вступают в контакт с последовательными основаниями ДНК и перестают двигаться, образуя комплексы с определенными комбинациями оснований. К этой группе относятся факторы транскрипции и репликации, которые участвуют в рекрутинге других белков, например ДНК-полимеразы, в соответствующие позиции [16].

Белки, которые неспецифически связываются с ДНК, в основном участвуют в упаковке ДНК в хромосомах и в стабилизации одноцепочечных сегментов ДНК. Однако такие клеточные процессы, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз, контролируются белками, которые связываются с ДНК сайт-специфическим образом [6]. Первичные структуры таких белков обычно имеют ДНК-связывающие мотивы, которые непосредственно контактируют с участками ДНК. Полученные комплексы характеризуются константами аффинности, которые в 102-106 раз выше констант аффинности возможных комплексов, образуемых пептидами с любыми другими участками ДНК [47].

Структурные исследования ДНК-белковых комплексов выявили два механизма распознавания белками участков связывания.

Первый — это прямое связывание, при котором функциональные группы аминокислотных остатков вступают в непосредственный контакт, например, через водородные связи, с определенными азотистыми основаниями (аденин, тимин, гуанин или цитозин). Такие белки обычно связываются с большой бороздкой ДНК, где могут образовываться многочисленные донорно-акцепторные связи. Таким образом, белки этой категории распознают свои участки связывания путем прямого зондирования поверхности ДНК, которая может изменяться в зависимости от лежащей в ее основе нуклеотидной последовательности. Типичными для этих белков являются структуры, известные как спираль-петля-спираль (например, в репрессоре бактериофага I, белке-репрессоре 434 или бактериальном Trp репрессоре), лейциновая застежка-молния (например, в белке GCN4) и цинковые пальцы (например, в транскрипционном факторе TFIIIA) [18, 38, 46].

Второй механизм распознавания участков связывания включает связывание белков внутри малой бороздки ДНК. Однако имеющиеся там доноры и акцепторы протонов сходны в любых нуклеотидных последовательностях, и это ставит под вопрос их специфическое распознавание белками. Таким образом, белки распознают дополнительные сигналы, такие как изменение ширины больших и малых бороздок, угла поворота спирали ДНК и ее жесткости, а также стейкинговые взаимодействия и другие физические свойства ДНК. К таким белкам относятся Lac-репрессоры, TATA-связывающие белки, рестриктазы и белки, участвующие в репарации ДНК. Механизм распознавания ДНК этими белками называется непрямым считыванием. Очень часто белком используются оба механизма [17].

Анализ ДНК-белковых комплексов, входящих в банк данных Rcsb Protein Data Bank (http:/www.rcsb.org) показывает, что среди азотистых оснований наиболее активным в плане взаимодействия с белками является гуанин, за ним следуют аденин, цитозин и тимин. На белковой стороне полярные боковые цепи наиболее важны для взаимодействия с основаниями ДНК. Среди аминокислот аргинин, лизин, серин и треонин наиболее способны образовывать множественные водородные связи с азотистыми основаниями. Кислотные остатки, такие как аспарагиновая и глутаминовая кислоты, менее способны взаимодействовать с ДНК из-за их неблагоприятных электростатических характеристик. Отрицательно заряженные аминокислоты отталкиваются от отрицательно заряженных фосфатов остова ДНК. Однако считается, что отрицательно заряженные аминокислоты способны взаимодействовать с азотными основаниями в большой бороздке, и эти взаимодействия специфичны. Среди нейтральных аминокислот только глицин способен образовывать множественные связи с ДНК [17].

Взаимодействие между ДНК и короткоцепочечными пептидами

Предполагается, что взаимодействие короткоцепочечных пептидов с их тканями-мишенями основано на способности этих пептидов проходить сквозь плазматическую и ядерную мембраны, проникать в клеточное ядро и ядрышко и там взаимодействовать с ДНК, регулируя эпигенетически экспрессию генов, ответственных за синтез сигнальных молекул и белков, важных для клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптоза, а также для транскрипции генов [4, 25, 28, 29].

Согласно результатам, полученным с помощью физических методов — ульрафиолетовой (УФ) спектроскопии, кругового дихроизма, вискозиметрии и атомно-силовой микроскопии, а также молекулярного моделирования, сигнальные пептиды способны связываться с ДНК в растворе in vitro [24, 26, 29, 31, 32, 34].

Этот процесс занимает несколько часов и происходит практически без электростатических сил. В результате образования комплекса, включающего азотистые основания в бороздке ДНК, наблюдается вызванная пептидами дестабилизация вторичной структуры ДНК. С помощью УФ-спектрофотометрии был обнаружен концентрационно-зависимый гиперхромный эффект (увеличение поглощения при 260 нм) в смеси эпиталона (AEDG) и двухцепочечной ДНК. Гиперхромный эффект указывает на то, что водородные связи между нуклеотидными парами двойной спирали ДНК частично разрушаются, и нити двойной спирали становятся локально разделенными.

Экспериментально установлено, что разделение нитей ДНК (плавление ДНК) происходит при температуре +69,5 °C со свободной синтетической ДНК и при температуре +28,0 °C со смесью ДНК и эпиталона. Таким образом, эпиталон облегчал разделение нитей ДНК при температурах, характерных для биохимических реакций. Важно отметить, что разделение цепей ДНК при физиологических температурах требуется для инициации экспрессии генов, но не является денатурацией ДНК.

Эти и другие теоретические рассуждения и экспериментальные данные позволили разработать модель взаимодействия пептидов с ДНК, предполагающую формирование стабильного ДНК-пептидного комплекса [33, 35]. С помощью молекулярного моделирования были определены основные физико-химические параметры комплекса (количество водородных связей, гидрофобные и электростатические взаимодействия, минимизация энергии при образовании ДНК-пептидного комплекса). На основе этих расчетов была предложена трехмерная модель взаимодействия эпиталона с последовательностями ATTTC в ДНК [30].

Открытие того, что пептиды способны связываться с олигонуклеотидами на конкретных участках (сайт-специфическим образом), может быть особенно важным для эпигенетического механизма регуляции экспрессии генов [23, 27]. Взаимодействие коротких пептидов с ДНК в ее одноцепочечной форме может контролировать экспрессию генов. Кроме того, связывание короткоцепочечного пептида эпиталона с ДНК сопровождается локальным разматыванием нитей ДНК, что может привести к появлению одноцепочечной мишени для связывания других пептидов с ДНК.

Взаимодействие короткоцепочечных пептидов с одно- и двухцепочечными дезоксирибо-олигонуклеотидами изучали с использованием препаратов ДНК фага лямбда [23, 27]. Определено влияние пептидов на спектры флуоресценции олигонуклеотидов, меченных 5,6-карбоксифлуоресцеином, и влияние ДНК фага лямбда на спектры флуоресценции пептидов, меченных флуоресцеина изотиоцианатом (FITC). Было обнаружено, что пептиды гасят флуоресценцию связанных с олигонуклеотидами флуорофоров. Это открытие предполагает, что пептиды связываются с ДНК. Было также установлено, что пептиды способны влиять на синтез белка и экспрессию генов [9]. Применение пептидов позволяет компенсировать изменения экспрессии генов в животных моделях патологических состояний. Эпиталон (AEDG), вилон (KE), тимоген (EW) и кортаген (AEDP) изменяют экспрессию 194 из 266 генов, изученных на животных моделях [3, 4]. Это согласуется с тем, что короткоцепочечные пептиды могут связываться с ДНК и регулировать активность генов эпигенетическим образом.

Наблюдались проявления сайт-специфических взаимодействий пинеалона (ERD) с ДНК. Пинеалон связывается с олигонуклеотидами, которые содержат последовательности CNG, предпочтительно последовательности CAG, делая эти сайты недоступными для ДНК-метилтрансфераз и, таким образом, оставляя промоторы генов неметилированными. Поэтому вполне возможно, что специфические (комплементарные) пептидно-ДНК взаимодействия контролируют синтез белка в нейронах [21].

Сравнение пространственного расположения функциональных групп на поверхности главной бороздки двухцепочечной ДНК и боковых групп регуляторных пептидов показало, что эпиталон может связываться с комплементарными участками ДНК промоторов генов, вызывая тем самым локальное разделение нитей ДНК и инициируя транскрипцию генов РНК-полимеразой II [22, 29].

Было обнаружено, что короткоцепочечные пептиды активируют гетерохроматин в клеточных ядрах старых людей и тем самым облегчают высвобождение генов из ингибирования, вызванного гетерохроматизацией эухроматиновых сегментов хромосом, которая происходит при старении [20, 23, 37] (табл.7).

Таблица 7. Влияние эпиталона (AEDG) и вилона (KE) на хроматин в лимфоцитах у людей пожилого возраста [21]

*p<0,05 по сравнению с молодыми людьми. ***p<0,001 по сравнению с контрольной группой старых пациентов.

Структурная конденсация хроматина тесно коррелирует с его функциональной неоднородностью. Существует два типа хроматина в ядрах клеток: светлый эухроматин и плотный гетерохроматин, который находится вблизи ядерной оболочки. Деконденсированные (эухроматические) сегменты хромосом функционально активны. Известно, что активный хроматин необходим для транскрипционной активности генов. Транскрипция генов ограничена эухроматином. С возрастом количество гетерохроматина в ядрах клеток увеличивается. Повышенная гетерохроматизация коррелирует с инактивацией генов, которые были активны раньше. Репликация плотно гетерохроматизированных сегментов хромосом задерживается. Регуляторные пептиды повышают содержание эухроматина в ядрах клеток. Это означает, что большее количество генов становится доступным для факторов транскрипции, усиливается транскрипция и увеличивается синтез белка. Большее количество эухроматина в клеточных ядрах означает, что синтез белка в клетках более активен. Результаты описанных выше экспериментов свидетельствуют о том, что возрастная гетерохроматизация является обратимой [21].

Взаимодействие веществ с малой бороздкой ДНК

По механизмам их взаимодействия с ДНК все вещества, как экзогенные, так и эндогенные, можно отнести к пяти типам:

• A. Интеркалирующие
• B. Металлосодержащие
• C. Разделяющие цепочки
• D. Нацеленные на бороздку ДНК

Только последний из вышеперечисленных механизмов был подтвержден в наших экспериментальных исследованиях короткоцепочечных пептидов и в клинических испытаниях препаратов на их основе. В настоящее время изучаются и другие возможные механизмы.

Двухцепочечная ДНК в своей форме B имеет большую и малую бороздки, ширина которых составляет 2,1 или 1,2 Å соответственно. Связывание с ними вещества, можно показать на примере природных антибиотиков нетропсина и дистамицина. Они связываются через свои положительно заряженные боковые группы с малой бороздкой ДНК в ее АТ-богатых областях. Это взаимодействие стабилизируется водородными связями и электростатическими и ван-дер-ваальсовыми силами. Эти два вещества не могут связываться с областями, богатыми GC, потому что NH2-группа гуанина вытеснит их из малой бороздки. Взаимодействие антибиотиков с малой бороздкой изменит компланарность нуклеотидных пар и исказит структуру ДНК [56, 8]. Кристаллическая структура комплекса нетропсина с додекамером ДНК была определена R. E. Dickerson и соавторами [36]. Молекула нетропсина связывается с ядром ДНК, получая доступ к нему из малой бороздки, образованной последовательностью AATT.

При взаимодействии с ДНК нетропсин или дистамицин вытесняет молекулы воды. Аминогруппы антибиотиков образуют водородные связи с N-3 атомами аденина и O-2 атомами тимина вдоль дна малой бороздки. Кроме того, ван-дер-ваальсовы силы между аденином и пиррольными кольцами антибиотиков участвуют в их взаимодействии с ДНК. Используя рентгеноструктурный анализ, аналогичные паттерны взаимодействий были обнаружены и в случае связывания дистамицина с последовательностями CGCAAATTTGCG [40]. AT-богатые участки ДНК в малой бороздке также участвуют в связывании ДНК-специфических красителей Hoechst 33258, SN6999 и их аналогов [49].

Хромомицин А3 и митрамицин — антибиотики, способные подавлять пролиферацию раковых клеток. Они выделяются из Streptomyces sp. В отличие от других веществ, способных связываться с малой бороздкой ДНК, эти антибиотики взаимодействуют с GC-богатыми последовательностями в присутствии ионов металлов, например Mg2+.

Структура комплекса между хромомицином и D(TTGGCCAA)2 определялась с помощью ядерного магнитного резонанса. В отличие от нетропсина и дистамицина, которые существенно не изменяют конформации ДНК, хромомицин расширяет малую бороздку и тем самым приводит к значительным конформационным изменениям в двухцепочечной ДНК. Специфичность связывания с GC основана на образовании водородной связи между С-8 или гидроксильной группой структуры антибиотика и атомом N-3 (акцептор) или NH-группой (донор) гуанина [42].

2. Моделирование взаимодействия короткоцепочечных пептидов с ДНК

В последние годы молекулярное моделирование все чаще используется для анализа наноструктур, в том числе короткоцепочечных пептидов. Истоки этого подхода прослеживаются еще в начале XX века. Первые успешные представления трехмерных молекулярных структур были вызваны достижениями в ядерной физике.

Ключевое значение для молекулярного моделирования имели достижения в области кристаллографии. Дополнительный подход к визуализации трехмерных структур кристаллов основан на построении молекулярных моделей с использованием конструктивных наборов, таких как шары и стержни, которые используются в моделях Дрейдинга. Эти модели обеспечивают удовлетворительные аппроксимации стерических изменений, возникающих в результате введения заместителей или образования водородных связей. В 1970-х годах были разработаны первые виртуальные модели Дрейдинга [43]. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик использовали молекулярные модели в своих первых попытках смоделировать структуру ДНК. Несколько позже были предложены механические аналогии молекулярных систем. Применяемый при моделировании подход силового поля все больше оптимизируется для достижения беспрецедентной эффективности.

В настоящее время молекулярное моделирование находит многочисленные применения в различных областях биологии, химии и медицины. Компьютерное моделирование физико-химических процессов позволяет решать многие задачи, с которыми сталкиваются экспериментаторы в своих эмпирических исследованиях. В частности, моделирование позволяет предсказать, как проявляются физико-химические свойства молекул в определенных условиях, и получить структурные детали биохимических процессов. Экспериментаторы могут лучше проектировать свои исследования, рассматривая многочисленные варианты и выбирая оптимальные из них [43].

Сила молекулярного моделирования применительно к короткоцепочечным пептидам

Молекулярное моделирование позволяет построить трехмерную химическую структуру короткоцепочечных пептидов с использованием специализированного программного обеспечения и баз данных о структурах и физико-химических свойствах атомов и молекул, в том числе макромолекул. Моделирование макромолекул включает в себя извлечение свойств атомов и молекулярных фрагментов из соответствующих баз данных и построение связей между этими элементами на основе валентностей [12].

Метод молекулярной механики позволяет рассчитать потенциальную энергию данной системы по закону Гука (Hooke’s law): атомы молекулы рассматриваются как упругие шарики разного размера, соединенные пружинами разной длины. Полная энергия такой системы вычисляется относительно начала координат энергии [41]:

Где E_tot полная потенциальная энергия макромолекулы; E_str — энергия растяжения связи; E_bend - энергия деформации валентного угла; E_tors — энергия деформации угла кручения; E_vdw — энергия ван-дер-Ваальса; E_elec — электростатическая энергия.

Полная стерическая энергия системы вычисляется для силового поля, определяемого набором регулируемых параметров (силовых констант) и стандартными значениями длины связи, валентности и углов кручения. Учитываются также ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Первый аддитивный элемент вышеприведенного уравнения фиксирует изменения энергии связи, возникающие в результате удлинения или сжатия связи относительно ее стандартной длины [2]:

где k_b— постоянная силы изменения длины связи; b₀ - — стандартная длина связи; а b — ее кажущаяся длина.

Угловые деформации фиксируются уравнением:

где k_θ— силовая постоянная деформации валентного угла; θ₀- — равновесное значение валентного угла; θ — его кажущееся значение.

Вклад вращения относительно двугранных углов вычисляется с помощью тригонометрического уравнения:

где: k_φ— торсионный барьер (вращательный барьер); φ — кажущийся угол кручения; n — число энергетических минимумов за один полный оборот; и φ₀ —стандартный угол кручения.

Ван-дер-ваальсовы взаимодействия между непосредственно соседними атомами обычно отражаются в потенциале Леннарда-Джонса (Lennard-Jones potential) [19]:

Где A_ij — коэффициент отталкивания; B_ij — фактор притяжения; и r_ij —расстояние между двумя атомами i и j.

Электростатические силы описываются функцией, полученной из уравнения Кулона (Coulomb equation) [15]:

где ω — диэлектрическая проницаемость; Q₁ и Q₂ — заряды взаимодействующих атомов; r — расстояние между атомами.

После построения компьютерных моделей пептидов и ДНК важным дальнейшим шагом является геометрическая оптимизация их структур, которая достигается путем минимизации суммарной энергии моделируемой системы. Эта процедура выполняется методом наиболее крутого спуска, который подразумевает постепенное смещение каждого атома молекулы в соответствующем фазовом пространстве по траектории, имеющей локальные энергетические минимумы в каждой из ее точек, до достижения абсолютного минимума. Этот подход применим к моделируемым структурам, начальные условия которых далеки от их минимальной энергии.

Расчеты в молекулярной механике делаются более точными с помощью метода сопряженных градиентов. В принципе, он подразумевает итеративное накопление информации о функции, подлежащей минимизации. Градиент энергии на каждом шаге итерации используется в качестве дополнительного фактора, включаемого в расчет следующего шага итерации. Таким образом, каждый последующий шаг устанавливает направление движения к абсолютному минимуму [45].

Эти процедуры приводят к серии трехмерных конфигураций молекулы, каждая из которых имеет свою собственную энергию. Важной задачей является нахождение конфигураций, имеющих сходные значения суммарной потенциальной энергии вокруг определенных локальных минимумов. Для этого используется метод конформационного поиска [44].

Конформационный анализ короткоцепочечных пептидов

Пептидные молекулы не являются жесткими, и при комнатной температуре их внутренняя кинетическая энергия может быть достаточно высокой, чтобы все атомы в их структурах находились в постоянном движении. Результирующие переходы между различными конформациями связаны с изменением углов кручения одиночных химических связей [14]. Структуры, обладающие максимальной энергией, нестабильны. Считается, что биологическая активность терапевтического препарата определяется единственной, так называемой “биоактивной” конформацией его молекул, которую необходимо найти среди всех возможных низкоэнергетических конформаций [13]. Основываясь на информации об активной конформации, можно построить новые активные лиганды для конкретных мишеней. Таким образом, нахождение низкоэнергетических конформаций имеет важное значение для понимания взаимосвязей между структурой и биологической активностью молекулы.

Для определения наиболее вероятной конформации пептида в водной среде важно учитывать влияние растворителя на поведение всей системы. Для расчета таких эффектов растворитель рассматривают как сплошную среду вокруг молекул растворенного вещества. Такой подход позволяет определить эффект сольватации при минимальных расчетных затратах на примере обобщенной модели Борна и площади поверхности (generalized Born and surface area model — GBSA) [48, 51].

Рис. 8 представляет собой низкоэнергетические конформации тетра- и трипептидов. Каждый пептид образует сеть внутримолекулярных водородных связей, показанных пунктирными линиями. Каждая молекула содержит полярный отрицательно заряженный кластер, образованный глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Таким образом, в водных средах пептиды образуют круговые структуры за счет нековалентных донорно-акцепторных электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными карбоновыми группами аспарагиновой или глутаминовой кислоты и положительно заряженными аминогруппами лизина или N-концевой аминокислоты. Сильные электростатические связи между положительно заряженным азотом и отрицательно заряженным кислородом стабилизируют полученную пространственную конформацию.

Рис. 8. Наиболее энергетически благоприятные конформации пептидов в водной среде при рН 7 и температуре 300 °К в силовом поле молекулярной механики Amber99 найдены с использованием CCG Molecular Operating Environment 2013. AEDG — эпиталон, KEDA — ливаген, AED — карталакс, EDR — пинеалон, EDL — оваген, KED —везуген. Отмеченные черным цветом пептидные остовы, которые включают атомы углерода, кислорода и азота. Пунктирные линии обозначают водородные связи.

Докинг анализ применительно к ДНК-пептидным комплексам

Докинг (docking, стыковка) — вариант компьютерного цифрового моделирования, направленного на определение оптимальной ориентации лиганда (пептида) относительно его рецептора (участка ДНК в пределах большой бороздки). Метод подразумевает приведение лиганда в его низкоэнергетическое состояние и его связывающего участка в контакт, вычисление энергии их взаимодействия (ккал/моль) и нахождение положения лиганда, минимизирующего эту энергию. При «полуупругой» стыковке учитывается только конформационная подвижность лиганда, тогда как азотистые основания ДНК считаются жесткими. При определении оптимальной ориентации пептида относительно двухцепочечной ДНК учитываются такие параметры, как площадь контакта, число водородных связей, гидрофобные и электростатические взаимодействия. Очень важно правильно подобрать силовое поле и правильный алгоритм поиска [41]. Общий алгоритм включает в себя расчет энтальпии образования пептидно-ДНК-комплекса:

dH = C_hb f_hb + C_ion f_ion + C_mlig f_mlig + C_hh f_hh + C_hp f_hp + C_aa f_aa ,

где каждый f — частично вычисленное межатомное взаимодействие, а C — соответствующий коэффициент для вычисления аффинности, индексы которого имеют следующие значения:

hb — взаимодействия в донорно-акцепторных парах

ion — электростатические взаимодействия между заряженными частицами 

mlig — взаимодействия между атомами азота, серы и переходных металлов

hh — взаимодействия между гидрофобными и полярными атомами (обычно они неблагоприятны)

aa — другие взаимодействия между любыми атомами (они обычно благоприятны, но слабы)

Предполагаемые механизмы действия пептидов — это регуляция генов путями, сходными с теми, которые характеризуются факторами транскрипции. Все факторы транскрипции имеют свои специфические участки связывания на молекулах ДНК. Факторы транскрипции распознают свои участки в регуляторных областях генов и связываются с ними, таким образом активируя или ингибируя экспрессию генов.

Геометрические свойства пептидов, имеющих до четырех аминокислотных остатков, позволяют таким пептидам легко проникать в большую бороздку ДНК и взаимодействовать там с азотистыми основаниями. В табл. 8 представлен результат использования стандартного программного пакета MOE 2014.10 для выполнения стыковки 16 короткоцепочечных пептидов со всеми возможными комбинациями четырех нуклеотидов, образующих последовательность ДНК. Для каждого пептида была определена последовательность ДНК, которая образует с ним наиболее энергетически благоприятный комплекс (табл. 8). Сильные взаимодействия с ДНК были обнаружены в случаях ливагена, панкрагена, пинеалона и кардиогена, которые все имеют положительно заряженные боковые цепи (Lys, Arg). Наиболее слабые взаимодействия характерны для всех дипептидов, вероятно, потому, что площади их контактов с ДНК невелики.

Таблица 8. Видимые участки ДНК для связывания короткоцепочечных пептидов

+ слабый (dH = -3 ккал/моль); ++ значительный (dH = -4,0-4,5 ккал/моль); +++ сильный (dH = -5-6 ккал/моль).

Для некоторых пептидов их участки связывания одинаковы. Например, вилон и кристаген связываются с AGAT. Оба пептида являются иммуномодуляторами. Они образуют водородные связи с N-7 и N-6 атомами аденина и с фосфатами остова ДНК. Однако кристаллоген образует только одну водородную связь с атомом N-4 цитозина. Поэтому энергия образования комплекса кристаллаген- AGAT ниже, чем у комплекса вилон—AGAT.

Пептиды панкраген и карталакс связываются с последовательностью ACCT (рис. 9). Площадь контакта с панкрагеном больше, чем с карталаксом, потому что первый имеет громоздкие боковые цепи лизина и триптофана. Таким образом, панкраген может полностью заполнить большую бороздку ДНК, предотвращая связывание других молекул с тем же участком. Связь панкрагена с последовательностью ACCT в три раза сильнее, чем связь карталакса (табл. 8). Оба пептида взаимодействуют с атомами N-4 и N-6 цитозина. Однако панкраген также взаимодействует и с N-7 аденина и образует сеть водородных и ионно-ионных связей с фосфатами остова ДНК. Хотя оба пептида связываются с одними и теми же участками, их эффекты могут быть различными. В случае с карталаксом его количество должно быть в три раза больше, чем у панкрагена, чтобы сделать эффекты обоих пептидов одинаковыми.

Рис. 9. Взаимодействие пептида с последовательностью ACCT в большой бороздке ДНК. А — панкраген; B — карталакс. Верхние цифры — 3D-модели линий и палочек. На нижних рисунках показаны соответствующие лиганд-рецепторные взаимодействия и направления переноса протонов. Нуклеотиды изображены в виде кругов: DA — аденозинмонофосфат; DC — цитозин монофосфат.

Пептиды бронхоген и оваген связываются с последовательностью CTCC ДНК. Энергии образования комплексов одинаковы для обоих пептидов (табл. 8). Поскольку они несут тяжелые отрицательные заряды, они не взаимодействуют с фосфатами остова ДНК. Их механизмы связывания схожи.

В целом молекулярный докинг оказался мощным методом поиска мишеней пептидов, имеющих различные аминокислотные последовательности. С помощью этого метода были определены селективные участки связывания для каждого из исследуемых пептидов, рассчитаны энергии комплексообразования, определены донорно-акцепторные, ионно-ионные и катионно-пи межмолекулярные взаимодействия и ориентации пептидов на участках их связывания.

Резюме

Предполагаемой мишенью для пептидов, описанных выше, является ДНК. Механизмы взаимодействий пептидов и ДНК зависят от аминокислотных последовательностей пептидов. Некоторые из них связываются в качестве акцепторов протонов только с азотистыми основаниями ДНК. Другие, которые действуют как доноры протонов, связываются как с азотистыми основаниями, так и с фосфатами остова ДНК. Такие пептиды содержат положительно заряженные боковые цепи и взаимодействуют с ДНК сильнее, чем другие пептиды. В эту группу входят панкраген (KEDW), пинеалон (EDR), ливаген (KEDA), и кардиоген (AEDR). Энергия образования комплекса с ДНК ниже в случае других пептидов. Можно предположить, что они действуют в силу некоторых других механизмов, таких как связывание с регуляторными белками или гистонами.

Дальнейшее развитие использованных нами методов позволит найти среди короткоцепочечных пептидов, в частности, новые активаторы экспрессии генов, обладающие заранее определенными эффектами.

Литература

1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science. 2002.
2. Allinger NL, Yuh YH, Lii JH. Molecular mechanics. The MM3 force field for hydrocarbons. J Am Chem Soc. Am Chem Soc. 1989;111(23):8551–66. 
3. Anisimov SV, Bokheler KR, Khavinson VKh, Anisimov VN. Elucidation of the effect of brain cortex tetrapeptide Cortagen on gene expression in mouse heart by microarray. Neuro Endocrinol Lett. 2004;25(1/2):87-93.
4. Anisimov VN, Khavinson VKh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. Biogerontology. 2010;11:139–49. 
5. Bailly C, Chaires JB. Sequence-specific DNA minor groove binders. Design and synthesis of netropsin and distamycin analogues. Bioconjug Chem. 1998;9(5):513–38. 
6. Barbi M, Place C, Popkov V, Salerno M. A model of sequence-dependent protein diffusion along DNA. J Biol Phys. 2004;30(3):203–26.
7. Cai Y-H, Huang H. Advances in the study of protein-DNA interaction. Amino Acids. 2012;43(3):1141–6. 
8. Coll M, Frederick CA, Wang AH, Rich A. A bifurcated hydrogen-bonded conformation in the d(A.T) base pairs of the DNA dodecamer d(CGCAAATTTGCG) and its complex with distamycin. Proc Natl Acad Sci USA. 1987;84(23):8385–9.
9. Dmitrieva VG, Dergunova LV, Povarova OV, Skvortsova VI, Limborskaya SA, Myasoedov NF. The effect of semax and the C-terminal peptide PGP on expression of growth factor genes and receptors in rats under conditions of experimental cerebral ischemia. Dokl Biochem Biophys. 2008;422:261–4. 
10. Fedoreyeva LI, Kireev II, Khavinson VKh, Vanyushin BF. Penetration of short fluorescence labeled peptides into the nucleus in HeLa cells and in vitro specific interaction of the peptides with deoxyribooligonucleotides and DNA. Biochem Moscow. 2011;76(11):1210–9. 
11. Fedoreyeva LI, Smirnova TA, Vanyushin BF, Sciences A. Interaction of short peptides with FITC-labeled wheat histones and their complexes with deoxyribooligonucleotides. 2013;78(2):166-75. 
12. Gasteiger J, Rudolph C, Sadowski J. Automatic generation of 3D-atomic coordinates for organic molecules. Tetrahedron Comput Methodol. 1990;3(6):537–47. 
13. Ghose AK, Crippen GM, Revankar GR, McKernan PA, Smee DF, Robins RK. Analysis of the in vitro antiviral activity of certain ribonucleosides against parainfluenza virus using a novel computer aided receptor modeling procedure. J Med Chem. 1989;32(4):746–56. 
14. Ghose AK, Jaeger EP, Kowalczyk PJ, Peterson ML, Treasurywala AM. Conformational searching methods for small molecules. I. Study of the sybyl search method. J Comput Chem. 1993;14(9):1050–65. 
15. Gilson MK, Sharp KA, Honig BH. Calculating the electrostatic potential of molecules in solution: Method and error assessment. J Comput Chem. 1988;9(4):327–35. 
16. Halford SE, Marko JF. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? Nucleic Acids Res. 2004;32(10):3040–52.
17. Hobza P, Nachtigallová D, Havlas Z, Maloň P, Šponar J. Interaction of Lysine-Alanine-Alanine tripeptide with a fragment of DNA: An empirical potential study. J Comput Chem. 1991;12(1):9–16. 
18. Johnson NP, Lindstrom J, Baase WA, von Hippel PH. Double-stranded DNA templates can induce alpha-helical conformation in peptides containing lysine and alanine: functional implications for leucine zipper and helix-loop-helix transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(11):4840–4. 
19. Jones JE. On the determination of molecular fields. I. From the variation of the viscosity of a gas with temperature. Proc R Soc A Math Phys Eng Sci. 1994;106(738):441–62. 
20. Khavinson VKh. Peptides and ageing. Neuro Endocrinol Lett. 2002;23(Suppl. special issue).
21. Khavinson VKh. Peptides, genome, aging. Adv Gerontol. 2014;4(4):337–45.
22. Khavinson V, Bondarev I, Butyugov A. Epitalon peptide induces telomerase activity and telomere elongation in human somatic cells. Bull Exp Biol Med. 2003;135(6):590-2.
23. Khavinson VKh, Fedoreeva LI, Vanyushin BF. Short peptides modulate the effect of endonucleases of wheat seedling. Dokl Biochem Biophys. 2011;437(1):64–7.
24. Khavinson VKh, Lezhava TA, Monaselidze JR, Jokhadze TA, Dvalis NA, Bablishvili NK, Trofimova SV. Peptide Epitalon activates chromatin at the old age. Neuro Endocrinol Lett. 2003;24(5):329-33. 
25. Khavinson VKh, Linkova NS, Polyakova VO, Kheifets OV, Tarnovskaya SI, Kvetnoy IM. Peptide tissue-specifically stimulate cell differentiation during their aging. Cell Technol Biol Med. 2012;1(5):148–51. 
26. Khavinson VKh, Malinin VV. Gerontological aspects of genome peptide regulation. Basel (Switzerland), Karger AG, 2005.
27. Khavinson VKh, Malinin VV, Vanyushin BF. Role of peptides in epigenetic regulation of gene activities in ontogeny. Bull Exp Biol Med. 2012;152(4):470–4.
28. Khavinson VKh, Sevostyanova NN, Durnova AO, Linkova NS, Tarnovskaya SI, Dudkov AV, Kvetnaia TV. Tetrapeptide stimulates functional activity of pancreatic cells in aging. Adv Gerontol. 2013;3(3):220–4.
29. Khavinson VKh, Shataeva LK, Chernova AA. Effect of regulatory peptides on gene transcription. Bull Exp Biol Med. 2003;136(3):288–90.
30. Khavinson V, Shataeva L, Chernova A. DNA double-helix binds regulatory peptides similarly to transcription factors. Neuro Endocrinol Lett. 2005;26(3):237-41.
31. Khavinson VKh, Solovyov AYu, Shataeva LK. Molecular mechanism of interaction between oligopeptides and double-stranded DNA. Bull Exp Biol Med. 2006;141(4):457-61.
32. Khavinson VKh, Solovyov AYu, Shataeva LK. Melting of DNA double strand after binding to geroprotective tetrapeptide. Bull Exp Biol Med. 2008;146(5):624-6.
33. Khavinson VKh, Solov'ev АY, Tarnovskaya SI, Lin'kova NS. Mechanism of biological activity of short peptides: Cell penetration and epigenetic regulation of gene expression. Biol Bull Rev. 2013;3(6):451-5. 
34. Khavinson VKh, Solov’ev AYu, Zhilinskii DV, Shataeva LK, Vanyushin BF. Epigenetic aspects of peptide-mediated regulation of aging. Adv Gerontol. 2012;2(4):277–86.
35. Khavinson VKh, Tarnovskaya SI, Linkova NS, Pronyaeva VE, Shataeva LK, Yakutseni PP. Short cell-penetrating peptides: a model of interactions with gene promoter sites. Bull Exp Biol Med. 2013;154(3):403-10.
36. Kopka ML, Yoon C, Goodsell D, Pjura P, Dickerson RE. The molecular origin of DNA-drug specificity in netropsin and distamycin. Proc Nat Acad Sci USA. 1985;82:1376–80.
37. Lezhava T, Khavinson V, Monaselidze J, Jokhadze T, Dvalishvili N, Bablishvili N, Barbakadze S. Bioregulator Vilon-induced reactivation of chromatin in cultured lymphocytes from old people. Biogerontology. 2004;5:73–9.
38. Lu Z, Cheng Z, Zhao Y, Volchenboum SL. Bioinformatic analysis and post-translational modification crosstalk prediction of lysine acetylation. PLoS One. 2011;6(12). 
39. Micans P. The new Russian peptide revolution. Aging Matters. 2016. (Spec 25 yrs ann edit):6-9.
40. Neidle S, Achari A, Taylor GL, Berman HM, Carrell HL, Glusker JP, Stallings WC. Structure of a dinucleoside phosphate–drug complex as model for nucleic acid–drug interaction. Nature. 1977;269(5626):304–7.
41. Samish I, MacDermaid CM, Perez-Aguilar JM, Saven JG. Theoretical and computational protein design. Annu Rev Phys Chem. 2011;62:129–49. 
42. Sastry M, Patel DJ. Solution structure of the mithramycin dimer-DNA complex. Biochemistry. 1993;32(26):6588–604.
43. Saxena A, Wong D, Diraviyam K, Sept D. The basic concepts of molecular modeling. Methods Enzymol. 2009;467:307–34.
44. Scheraga HA. Theoretical and experimental studies of conformations of polypeptides. Chem Rev. 1971;71(2):195–217. 
45. Schlick T, Olson WK. Supercoiled DNA energetics and dynamics by computer simulation. J Mol Biol. 1992;223(4):1089-119.
46. Seeman NC, Rosenberg JM, Rich A. Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Science. 1976;73(3):804–8. 
47. Slutsky M, Mirny LA. Kinetics of protein-DNA interaction: facilitated target location in sequence-dependent potential. Biophys J. 2004;87(6):4021–35. 
48. Still WC, Tempczyk A, Hawley RC, Hendrickson T. Semianalytical treatment of solvation for molecular mechanics and dynamics. J Am Chem Soc. Amer Chem Soc. 1990;112(16):6127–9. 
49. Vega MC, Saez IG. Three-dimensional crystal structure of the A-tract DNA dodecamer d(CGCAAATTTGCG) complexed with the minor-groove-binding drug Hoechst 33258. Biologia (Bratisl). 1994;726:721–6. 
50. Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 1953;171:738-40.
51. Wojciechowski M, Lesyng B. Generalized born model: analysis, refinement, and applications to proteins. J Phys Chem B. Amer Chem Soc. 2004;108(47):18368–76.